文献解读急性川崎病患者PBMC的

年9月14日，中国科学院上海营养与健康研究所王振医院黄敏教授团队合作在NatureCommunications上在线发表关于川崎病（Kawasakidisease，KD）外周血单个核细胞免疫图谱。研究人员采用单细胞RNA测序从7例急性KD患者中分离的外周血单核细胞（PBMC），发现在KD的发病机制和治疗中，单核细胞是促炎介质的主要来源，另外浆细胞和效应记忆CD8+T细胞也参与KD，每种细胞类型都具有独特的动态免疫应答。

接下来小编带大家一起走进这篇文章深入了解作者的研究思路及主要结论

01

研究背景

川崎病（KawasakiDisease,KD）是一种全身性的血管性炎性疾病，自年川崎富作医生报告以来，世界各地均有报道。KD为儿童期常见的一种急性自限性血管炎，好发于婴幼儿。如果治疗不及时，KD有可能导致冠状动脉病变（CALs），其后遗症也是成人缺血性心脏病的重要原因之一。

有研究发现，KD与遗传因素和感染有着一定关系。在遗传易感儿童中发现易感基因包括ITPKC，CASP3和FCGR2A等，在病原体（超抗原毒素、爱泼斯坦-巴尔病毒、冠状病毒和逆转录病毒）也可能会导致机体过度的免疫应答，损害血管壁，但没有一个后续被研究证实。目前对KD的诊断还主要依靠临床特征，包括发热、皮疹、结膜炎、口腔黏膜和四肢的变化等，但这些症状与许多儿童发热性疾病相似。在发热后10天内大剂量静脉注射免疫球蛋白（IVIG），可有效降低冠状动脉损伤的发生率，IVIG治疗KD的机制尚不清楚，还有少部分患儿对免疫球蛋白治疗无反应。因此寻找川崎病的及时诊断方法和新的治疗方法仍然十分必要。

02

研究思路

03

研究结果

1.KD患者的单细胞RNA分析作者从7名急性KD患者的14份新鲜外周血选取84,细胞，进行单细胞RNA测序。每名患者在IVIG治疗前，发烧后的第5天采集第一份血样，第二个样本是在完成IVIG治疗结束和退烧后24小时内获得的，所有患者均对IVIG治疗均有反应且未发生CAL。另外收集了三名年龄匹配的健康儿童的新鲜外周血液样本作为对照组。采用10xGenomics平台对从外周血液中分离的84,个PBMC进行单细胞RNA测序，另外还进行了单细胞B细胞受体测序和单细胞T细胞受体测序。通过对数据的聚类注释后，获得T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤（NK）细胞、B细胞、单核细胞、髓样树突状细胞、浆细胞样树突细胞（pDCs）、造血干细胞和祖细胞，还有残留在PBMC中的红细胞和巨核细胞。实验结果显示和健康对照相比，治疗前KD患者的单核细胞和B细胞比例增加，而T细胞和NK细胞比例降低（图1）。图1川崎病治疗前后及健康对照的外周血单细胞免疫图谱2.PBMCs中免疫细胞类型的动态变化通过单细胞RNA测序比较KD患者在IVIG治疗前、后与健康对照组每种免疫细胞类型的百分比（图2a），通过流式细胞术分析16名KD患者和20名健康儿童的外周血淋巴细胞比例（图2b）。结果发现，KD患者治疗前B细胞比例高于治疗后，而CD4+T细胞比例却是降低的（图2a）。与健康对照相比，KD患者治疗前B细胞的比例显着增加，IVIG治疗后迅速恢复正常（图2b）。以往实验发现IVIG治疗后单核细胞的表达量降低，而单细胞RNA测序中的一名患者（P1）显示治疗后单核细胞的比例增加（图2a）。为了排除任何潜在的偏差，检查患者的常规血液检测数据，数据证实治疗后单核细胞总体上减少，而只有P1显示出与单细胞RNA测序相反趋势。图2不同条件下主要细胞类型的比较3.单核细胞亚群和免疫反应通过研究每种细胞类型的亚群来剖析它们的异质性。单细胞RNA测序发现单核细胞有两个亚群，包括CD14+单核细胞和CD16+单核细胞。IVIG治疗后，患儿CD16+单核细胞比例降低（图3a）。通过对每种细胞亚群进行差异表达分析，来确定与免疫反应相关的基因，发现多数DEG来自PBMC中的单核细胞，通过DEG的GO注释和通路富集分析，显示单核细胞显著富含S蛋白、免疫球蛋白受体和细胞因子受体。SA8、SA9和SA12主要由中性粒细胞和单核细胞表达，它们在一系列疾病中发挥促炎功能，这些基因在治疗前中高表达的（图3b）。另外编码免疫球蛋白受体的DEG在治疗前高表达。相反与健康对照相比，KD患者中编码MHCII类受体表达下降（图3b）。编码细胞因子和趋化因子受体的DEG的表达模式更加多样化，在一些治疗前患者中过度表达，包括IFNAR2、IFNGR2、IL3RA、IL10RB和CX3CR1，但在一些治疗后患者或健康对照中过度表达，包括IL7R、IL13RA1、IL6ST和CXCR3（图3b）。高细胞分裂素血症KD最重要的特征之一，IL-1β和TNF-α是KD发病过程中的关键炎症介质，并已被用作治疗IVIG耐药患者。结果发现IL-1B和TNF-α主要在PBMC中的单核细胞中表达，并且在治疗前KD患者中上调（图3d）。另外单核细胞也表达CCL2、CXCL10、CXCL8、HGF、IL15、IL18、RETN和TNFRSF1B（图3c）。图3单核细胞的表征和转录模式4.B细胞亚群和BCR谱系作者确定了四个B细胞亚群，包括原始B细胞、记忆B细胞、浆细胞以及介于幼稚和记忆细胞之间的细胞（图1）。在IVIG治疗后，浆细胞占总B细胞比例较治疗前升高（图4a）。通过对另外16名KD患者和20名健康儿童进行流式细胞术分析（图4b），证实治疗后患者的浆细胞比例高于治疗前患者和健康对照组。与治疗后患者相比，治疗前KD患者中与细胞周期呈正相关的DEG上调，而在治疗前患者中抑制细胞周期的DEG下调（图4c）。通过分析scBCR-seq数据发现急性KD期间BCR谱系的动态变化，在IVIG治疗后IGHA和IGHG的比例明显升高（图4d），这表明免疫球蛋白从IgM/IgD到IgG/IgA的同型转换是由B细胞激活的。通过对患者VDJ序列分析BCR的克隆性，发现在除P7之外的大多数患者中，治疗后克隆BCR（克隆大小≥3）的比例明显增加（图4e）。特别是在除P7之外的每个治疗后患者中，都可以观察到以IgA和IgG为主的克隆性扩张（图4e）。图4川崎病治疗过程中B细胞受体（A）和T细胞受体（B）的克隆扩增

5.T和NK细胞亚群以及TCR谱系

CD4+T和CD8+T细胞均包含三个亚群：初始细胞、中央记忆细胞和效应记忆细胞。作者发现KD患者CD8+T细胞初始细胞的比例显著增加，而效应记忆细胞的比例明显降低（图5a）。对16名KD患者的CD8+T细胞亚群进行流式细胞术分析，进一步证明初始细胞比例升高和效应记忆细胞降低，并且不受IVIG治疗的影响（图5b）。

NK细胞包括两个亚群：高CD16细胞和高CD56细胞，治疗后高CD16细胞的比例降低与CD16+单核细胞的趋势相似。在CD4+T和CD8+T细胞中一组DEG显著富集干扰素信号传导和反应（图5c）。与B细胞类似，KD患者淋巴细胞群中S基因的表达均高于对照组（图5c）。GSEA发现CD4+T和CD8+T细胞中几个标志性基因集的显著协调变化（图5d），其中与治疗后患者和健康相比，治疗前患者MYC被激活。在这两种CD4+T和CD8+T细胞亚群中，MYC靶基因在治疗前显著上调（图5e）。FOXP3是调节性T细胞的典型标志物，也是CD4+T细胞特异性DEG，在IVIG治疗后FOXP3的表达上调（图5e）。

与BCR谱系相似，IVIG治疗后，大多数患者的克隆TCR比例明显增加（图5f），且在克隆TCR中没有发现任何主要的TRBV家族（图5f)，这些结果证明常规抗原可能是导致KD的致病原因。

图5T细胞和TCR的表征

04

研究结论

通过对7名急性KD患者治疗前后和3名健康对照的外周血单核细胞进行单细胞RNA测序方法，鉴定每种细胞类型基因具有独特的表达特征，大部分DEG由单核细胞产生。在急性KD患者中MHCII类基因相对于健康对照组的低表达，在GWAS中，免疫球蛋白受体和MHCII类受体的基因簇也被确定为KD的易感基因，突出了它们在KD发病机制中的重要作用。另外发现淋巴细胞群在治疗后总B细胞显著降低，但B细胞中浆细胞的比例升高。在急性期，CD8+T细胞比例明显低于健康对照组，尤其是效应记忆性CD8+T细胞。作者确定了KD患者中每种细胞类型变化背后的生物过程，先天性和适应性免疫反应的单细胞景观提供了对KD发病机制和治疗的见解。

参考文献

Wang,Z.,Xie,L.,Ding,G.etal.Single-cellRNAsequencingofperipheralbloodmononuclearcellsfromacuteKawasakidiseasepatients.NatCommun12,().

转载请注明：http://www.gmuzc.com/jmyzl/14019.html